差示掃描熒光法（Differential Scanning Fluorimetry, 簡(jiǎn)稱DSF），是在熒光定量PCR儀上緩慢加熱樣品，在加熱的過程中檢測(cè)熒光染料與結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的蛋白質(zhì)相結(jié)合的量，來(lái)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的方法。該方法具有蛋白樣品損耗少、通量高、溫度變化范圍廣及數(shù)據(jù)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性（蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性參數(shù)及其影響因素）、蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象、蛋白-配體相互作用及蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、抑制劑、輔助因子等領(lǐng)域的研究。
01 DSF原理
DSF可以通過熒光染料或蛋白內(nèi)源熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)升溫過程中蛋白構(gòu)象的變化計(jì)算其熔解溫度Tm（折疊蛋白與去折疊蛋白相等時(shí)的溫度）。染料法DSF最常用的是SYPRO Orange染料，SYPRO Orange 是一種環(huán)境敏感的疏水染料，當(dāng)溫度升高時(shí)，蛋白去折疊，疏水部分暴露出來(lái)，染料與蛋白質(zhì)的疏水部分特異性結(jié)合，熒光增強(qiáng)。在有特定化合物或配體結(jié)合的情況下，蛋白穩(wěn)定性會(huì)上升，表現(xiàn)為熔解溫度的上升。
圖1. 染料法DSF
無(wú)標(biāo)記DSF (Nano DSF）則是基于蛋白去折疊過程中色氨酸發(fā)射光譜的位移進(jìn)行檢測(cè)。因此，通過檢測(cè)熒光變化，可實(shí)現(xiàn)在非標(biāo)記環(huán)境下評(píng)估蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、膠體穩(wěn)定性、等溫穩(wěn)定性、變復(fù)性能力等性質(zhì)。
圖2. Nano DSF
02 DSF測(cè)試過程
1、儀器準(zhǔn)備
DSF主要是利用熒光定量 PCR 儀在 96 孔或 384 孔 PCR 板上完成平行檢測(cè)，以實(shí)現(xiàn)高通量篩選目的蛋白和化合物。
2、樣品準(zhǔn)備
蛋白樣品需要較高的純度（～75%），化合物的純度通過 LC-MS 質(zhì)檢；SYPRO Orange 是目前DSF實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的染料，方便且高效。此外，也有一些特殊的染料用于特定蛋白的研究，例如 1,8-ANS、2,6-ANS、2,6-TNS、oxazole 系列和 BODIPY、BFC 系列染料探針。
3、反應(yīng)體系配置
根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)把蛋白和配體配置成不同濃度的體系，置于 96 孔板或 384 孔板。緩沖液可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行更換。DSF 的反應(yīng)體系主要包括蛋白樣品、反應(yīng)緩沖液、熒光染料及候選的化合物配體，每檢測(cè)孔樣品體積為 20～25 L，以蛋白緩沖液作為空白對(duì)照，每個(gè)檢測(cè)組設(shè)三組重復(fù)。
4、上機(jī)
將上述配置好的體系放入熒光定量 PCR 儀中，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別調(diào)至熒光染料相應(yīng)波長(zhǎng)， 升溫速率通常設(shè)為 1 ℃/10s，溫度變化范圍一般從 25 ℃ 到 75 ℃ 或 100 ℃ 不等，每 1～3 ℃ 測(cè)定一次熒光強(qiáng)度（實(shí)驗(yàn)條件會(huì)根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化）。
5、數(shù)據(jù)分析
通過數(shù)據(jù)處理軟件，繪制出熒光強(qiáng)度隨溫度的變化曲線，通過擬合波爾茲曼（Boltzmann transport equation，BTE）方程，計(jì)算出蛋白樣品的 Tm 值及相關(guān)參數(shù)。
03 DSF優(yōu)點(diǎn)
1、Nano DSF無(wú)需染料：直接檢測(cè)蛋白紫外熒光；
2、初步或者大量檢測(cè)蛋白與化合物之間是否有結(jié)合力；
3、低樣品消耗量：每個(gè)樣品僅需10 μL，最低濃度僅需0.5 μg/mL；
4、數(shù)據(jù)精度高：CV<0.1% (Tm)；
5、溫度變化范圍廣。
04 DSF應(yīng)用
1、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性評(píng)估
大多數(shù)蛋白質(zhì)對(duì)溫度要求較高，評(píng)估其熱穩(wěn)定性對(duì)更好地發(fā)揮其功能非常重要。DSF不但可以高通量測(cè)定蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定參數(shù)，還能評(píng)估突變、pH、離子強(qiáng)度等其他因素對(duì)熱穩(wěn)定性的影響，篩選出提高熱穩(wěn)定性的因素。
圖3. DSF檢測(cè)不同 pH 對(duì)蛋白熱穩(wěn)定性的影響
2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究
蛋白質(zhì)結(jié)晶是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一個(gè)非常重要的手段，DSF可以高通量篩選蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件。
3、蛋白質(zhì)-配體相互作用研究
配體與蛋白質(zhì)結(jié)合一般會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性改變，DSF可以通過測(cè)定蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性參數(shù)評(píng)估配體與蛋白質(zhì)之間的相互作用。
4、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、抑制劑的高通量篩選
通過對(duì)化合物配體庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，獲得與蛋白樣品相結(jié)合的候選化合物，評(píng)估化合物對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響，從而篩選出蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、抑制劑、輔助因子及分子伴侶。
圖4. DSF檢測(cè)蛋白與配體的結(jié)合
5、小分子化合物抑制機(jī)制研究
利用 DSF 可以進(jìn)行高通量、矩陣式的多種化合物檢測(cè)（化合物與一些已知的抑制劑、底物、產(chǎn)物或輔助因子等結(jié)合），用于小分子化合物抑制劑的篩選及其藥理機(jī)制的研究。