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細(xì)胞的分離是指根據(jù)細(xì)胞所具有的特性把某種特定的細(xì)胞亞群從混合的細(xì)胞樣品中分離出來(lái)的一種技術(shù)，它是對(duì)某一特定細(xì)胞進(jìn)行生化分析和功能分析的前提和基礎(chǔ)。

細(xì)胞的分離根據(jù)其大小、密度、表面電荷、吸附能力或表面抗原的差異等，總體上可分為三種：基于細(xì)胞不同黏附特性的分選技術(shù)、基于細(xì)胞物理性能的分選技術(shù)和基于生化親和力的細(xì)胞分選技術(shù)。

另外，葡聚糖凝膠G-10也可用來(lái)分離細(xì)胞，其原理同樣是利用細(xì)胞的黏附特性，使之黏附于葡聚糖凝膠從而將異質(zhì)性細(xì)胞懸液中具黏附能力的細(xì)胞去除。
二、基于細(xì)胞物理性能的分選技術(shù)
該方法通常基于細(xì)胞本身的物理特性（如大小或密度等），在外部作用（如聲波、流體動(dòng)力和電場(chǎng)等）條件下，對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分離純化。如通過(guò)密度梯度離心分選不同沉降系數(shù)的細(xì)胞、通過(guò)過(guò)濾分選不同大小的細(xì)胞。

過(guò)濾法使用孔徑6.5-8μm的細(xì)胞篩過(guò)濾，分離出體積較小的細(xì)胞和體積較大的細(xì)胞。
2、離心技術(shù)

當(dāng)離心機(jī)驅(qū)動(dòng)時(shí)，樣品溶液做勻速圓周運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生一向外的離心力。由于不同顆粒的質(zhì)量、密度、大小及形狀等各不相同，在同一固定大小的離心場(chǎng)中沉降速度也就不同。

大于周圍介質(zhì)密度的顆粒將離開軸心方向而發(fā)生沉降，而低于周圍介質(zhì)密度的顆粒移向軸心方向而發(fā)生漂浮，從而實(shí)現(xiàn)相互間的分離。

相對(duì)離心力(RCF)：在離心力場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球引力的倍數(shù)，以g為單位。轉(zhuǎn)速(rpm)：離心時(shí)每min旋轉(zhuǎn)次數(shù)，單位為r/min。轉(zhuǎn)換公式：g=r×11.8×10??×rpm2，r為有效離心半徑，即從離心機(jī)軸心到離心管底的長(zhǎng)度，單位為厘米（cm）。
2）差速離心法
差速離心差速離心主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達(dá)到分離不同大小顆粒的目的。

差速離心只用于分離大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。通過(guò)差速離心可將細(xì)胞器初步分離，由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，常需進(jìn)一步通過(guò)密度梯離心再行分離純化。
2）密度梯度離心
密度梯度離心是用一定的惰性介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。

密度梯度離心中樣品組份的分離是借助于混合樣品穿過(guò)密度梯度層的沉降或上浮來(lái)達(dá)到的。

密度梯度離心使用一種轉(zhuǎn)速，而差速離心使用多個(gè)離心轉(zhuǎn)速。密度梯度離心適宜分離密度有一定差異的樣品，而差速離心則適用于分離混合樣品中各沉降系數(shù)差別較大的組分。

這種方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度，而且在最大顆粒沉降至管底前須停止離心。

大的離心力、長(zhǎng)的離心時(shí)間都對(duì)細(xì)胞不利。大細(xì)胞比小細(xì)胞更易受高離心力的損傷，而且停留在等密度介質(zhì)中的細(xì)胞比處在移動(dòng)中的細(xì)胞受到更大的損傷。因此，這種方法適于分離細(xì)胞器，而不太適于分離和純化細(xì)胞。

③密度梯度離心介質(zhì)

用于分離細(xì)胞的密度梯度材料應(yīng)該具備一定的條件：對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性；不會(huì)滲入細(xì)胞內(nèi)部；易從收集液中除去分離介質(zhì)；較低的黏性系數(shù)；PH中性或易調(diào)為中性；梯度液必須是等滲的，沿整個(gè)離心管長(zhǎng)度方向滲透壓變化要小于10%，以保證其基本性狀在離心分離前后基本一致。

其原理是離心過(guò)程中產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力使氯化銫鹽向離心管底沉降。由于離心的作用管底鹽溶液濃度高，所以在離心場(chǎng)中鹽還受到擴(kuò)散作用向管口移動(dòng)其擴(kuò)散的作用力肯定比離心力要小得多，但如果離心時(shí)間足夠長(zhǎng)，沉降和擴(kuò)散之間就會(huì)達(dá)到一個(gè)平衡，這時(shí)從管的頂部到底部形成了一個(gè)線性的密度增加的梯度。

氯化銫的高密度和穩(wěn)定的梯度特性得益于其較大的離子半徑和相對(duì)松散的電子結(jié)構(gòu)，這使得氯化銫的電荷密度較小，能夠與其他離子形成更緊密的晶格結(jié)構(gòu)，從而增加溶液的密度。

將含有生物大分子和氯化銫的均勻溶液注入離心管中，經(jīng)過(guò)足夠時(shí)間的離心后，氯化銫會(huì)在離心場(chǎng)內(nèi)沉降，形成穩(wěn)定的連續(xù)梯度。與此同時(shí)，生物大分子會(huì)向相當(dāng)于其自身浮力密度的某個(gè)位置移動(dòng)，形成一條狹窄的帶。

Percoll的硅膠顆粒大小不一，在離心過(guò)程中可迅速形成連續(xù)密度梯度區(qū)，是高濃度蔗糖的較好替代品，但缺點(diǎn)是較難去除。應(yīng)用范圍較廣，不僅僅適于分離不同密度的細(xì)胞，還可分離亞細(xì)胞器和病毒，可實(shí)現(xiàn)從1.02-1.3g/ml范圍內(nèi)的密度梯度離心分離。
④具體應(yīng)用
a.Ficoll密度梯度離心法分離PBMC
外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，是指外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其他少量細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其它細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞的比重超過(guò)1.080，單個(gè)核細(xì)胞的比重為1.070左右，血小板為1.030左右。

利用Ficoll作密度梯度離心時(shí)，各血液成分將按密度梯度重新分布聚集：血漿和血小板密度較低，懸浮于分離液的上部；紅細(xì)胞與粒細(xì)胞密度較大，沉于分離液的底部；PBMC密度稍低于分離液，位于分離液界面之上，移去上層組分就可獲得PBMC。
b.Percoll密度梯度離心法分離BMSC
BMSC，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用Percoll作密度梯度離心時(shí)，紅細(xì)胞及多核細(xì)胞因比重(1.080g/mL) 較大而沉降于底部，其次是單個(gè)核細(xì)胞（包括BMSCs、造血干細(xì)胞、單核細(xì)胞等），懸浮密度位于(1.056-1.075) g/mL，血漿及其溶解物懸浮密度位于1.050g/mL。

整個(gè)梯度離心要求慢升慢降，需要在離心機(jī)里設(shè)置加速度，一般有1到9級(jí)可選。Percoll升降都要3的加速度; Ficoll升速時(shí)沒(méi)有要求，降速時(shí)要慢，建議關(guān)閉剎車，設(shè)置加速度為3。
1、免疫溶解法
當(dāng)補(bǔ)體存在時(shí)，用抗細(xì)胞某一表面標(biāo)志的特異性抗體與異質(zhì)性細(xì)胞一起孵育，可以是具有該特異性表面標(biāo)志的細(xì)胞溶解。

利用這一原理，可將消除細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志的抗體和補(bǔ)體加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，使抗體及補(bǔ)體作用于具有相應(yīng)抗原的細(xì)胞并溶解之，而對(duì)該抗原陰性的細(xì)胞進(jìn)行富集。

免疫磁珠分選法分為正選法和負(fù)選法。在正選法中，磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞；而在負(fù)選法中，磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于上清液的細(xì)胞即為所需目的細(xì)胞。
4、選擇性的細(xì)胞凝集/形成玫瑰花結(jié)
羥乙基淀粉和甲基纖維素可以使紅細(xì)胞形成大的"錢串"，加速其沉降，從而比其他細(xì)胞更快地從造血細(xì)胞懸液中沉降出去。這一方法通常用于快速去除大量成熟的紅細(xì)胞,而不會(huì)對(duì)有核細(xì)胞群造成太大的損失。

一、基于細(xì)胞不同黏附特性的分選技術(shù)

黏附于某些固相物質(zhì)如玻璃或塑料的表面,是某些類型細(xì)胞的基本生物學(xué)特性之一，但另一些細(xì)胞卻缺乏這種能力，或某些細(xì)胞的黏附能力強(qiáng)、黏附作用快，而另一些細(xì)胞黏附能力弱或黏附作用慢。

根據(jù)這些差異，可以分離或消除某些類型的細(xì)胞。這種將黏附較快的細(xì)胞與黏附較慢（或無(wú)黏附能力)的細(xì)胞分開并分別收集的處理過(guò)程就稱為差速黏附處理。

差速黏附處理常用于分離細(xì)胞懸液中的成纖維細(xì)胞與其他組織細(xì)胞。

1、過(guò)濾法(細(xì)胞篩法)

離心技術(shù)是利用物體高速旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，使樣品中的懸浮顆粒發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒得以濃縮或與其他顆粒分離。這里的懸浮顆粒可以是懸浮狀態(tài)的細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒和生物大分子等。

1）影響離心力的因素

影響離心力的因素有相對(duì)離心力、轉(zhuǎn)速、離心半徑R、離心時(shí)間等。(Fc) = m×r×ω2(m,質(zhì)量；ω,角速度,等于2πrpm)。

離心力作用于微粒上，具有時(shí)間積累效應(yīng)，對(duì)同一懸浮液可以在較低轉(zhuǎn)速較長(zhǎng)時(shí)間得到以較高轉(zhuǎn)速較短時(shí)間條件下相同的分離效果。

由于某些待分離物質(zhì)在長(zhǎng)時(shí)間離心時(shí)容易失去生物活性，因此我們往往需要根據(jù)待分離物質(zhì)的具體特點(diǎn)選擇適合的轉(zhuǎn)速和分離時(shí)間的組合。

①速度沉降

速度沉降是利用不同顆粒在梯度介質(zhì)中的沉降系數(shù)的不同而分離，具有相同沉降系數(shù)的顆粒將處于同一梯度層。主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。

②等密度沉降

等密度沉降適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長(zhǎng)時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。等密度沉降通常在較高密度的介質(zhì)中進(jìn)行。

介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。再者，這種方法所需要的力場(chǎng)通常比速率沉降法大10-100倍，故往往需要高速或超速離心，離心時(shí)間也較長(zhǎng)。

密度梯度離心常用的介質(zhì)有蔗糖、氯化銫（CsCl）、聚蔗糖（Ficoll）、Ficoll-Paque(泛影酸鈉)、聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠（Percoll）、碘化介質(zhì)（如Nycodenz、metrizamide）等多種。

a.氯化銫

氯化銫是一種重金屬鹽、易溶于水，可形成1-1.9g/cm3的密度梯度。氯化銫溶液在離心后會(huì)自行形成并保持一個(gè)自上而下的連續(xù)密度梯度，其中頂部濃度較低，而底部濃度較高。

b.蔗糖

蔗糖因其價(jià)格低廉、溶解度高而被普遍采用，但高濃度蔗糖黏度大、滲透壓高，不適于分離對(duì)滲透壓敏感的細(xì)胞器。

c.Ficoll

Ficoll是蔗糖的多聚體，中性，平均分子量400000，當(dāng)密度為1.2g/mL，未超出正常生理性滲透壓，也不穿過(guò)生物膜，適于已知密度細(xì)胞的分離，如PBMC。

d.Percoll

Percoll是一種PVP涂層的硅膠顆粒介質(zhì)，擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定，滲透壓很低，粘性也很小，不穿透生物膜，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害。Percoll PLUS是共價(jià)偶聯(lián)烷硅涂層硅膠介質(zhì)，性質(zhì)更加穩(wěn)定；Percoll PLUS內(nèi)毒素含量較低(<2EU/ml)，可以用于臨床研究，Percoll僅能用于科研。

3、細(xì)胞電泳

在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場(chǎng)的作用下發(fā)生泳動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞電泳。引起細(xì)胞電泳的電位值稱為ξ電位，各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞荷電量有所不同，故在一定的電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度不同。

在恒定的電場(chǎng)條件下，同種細(xì)胞的電泳速度相當(dāng)穩(wěn)定，因而可通過(guò)測(cè)定電泳速度來(lái)推算出細(xì)胞的ξ電位。ξ電位常因細(xì)胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)而異，因此在診斷疾病上有一定價(jià)值。此外由于不同類型的細(xì)胞在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度不同，細(xì)胞電泳可用來(lái)分離不同種類的細(xì)胞，例如可把淋巴細(xì)胞與造血細(xì)胞分開。

三、基于生化親和力的細(xì)胞分選技術(shù)

單克隆抗體的特異性和多樣性使利用不同抗體的合理組合分離不同類型的細(xì)胞成為可能。目前，抗體介導(dǎo)的細(xì)胞分離技術(shù)主要有抗體/補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解法，流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選法，平面黏附分離法，免疫磁珠分離法等。

2、流式細(xì)胞分選術(shù)

利用一個(gè)或數(shù)個(gè)熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗體與細(xì)胞孵育以進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記好的細(xì)胞懸液放入樣品管中，被高壓壓入流動(dòng)室內(nèi)。流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的包裹和推動(dòng)下，細(xì)胞被排成單列，以一定速度從流動(dòng)室噴口噴出。在流動(dòng)室的噴口上配有一個(gè)超高頻的壓電晶體，充電后振動(dòng)，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測(cè)細(xì)胞就分散在這些液滴之中。

將這些液滴充以正、負(fù)不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)過(guò)帶有幾千伏的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，沒(méi)有充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。

3、免疫磁珠分選法

免疫磁珠分選法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合的原理。在外加磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無(wú)該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒(méi)有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。

血液或骨髓中的T細(xì)胞可以通過(guò)與綿羊紅細(xì)胞發(fā)生凝集而除去，凝集的形成是由于T細(xì)胞表面的CD2分子和綿羊紅細(xì)胞上特異的配體相互作用的結(jié)果，形成玫瑰花結(jié)的細(xì)胞與沒(méi)有形成玫瑰花結(jié)的細(xì)胞通過(guò)密度梯度離心即可分開。

參考文獻(xiàn)：

［1］細(xì)胞分離技術(shù)-百度百科

［2］干細(xì)胞分離:密度梯度離心法、免疫磁珠分選法和流式細(xì)胞儀分離法-賽業(yè)廣州生物

［3］Percoll 、Ficoll 深度詳解，讓你的細(xì)胞分離不再難-優(yōu)寧維生物

［4］細(xì)胞分離純化的幾項(xiàng)常用技術(shù)_中科博生

［5］2.2生物大分子的提取、純化、濃縮-轉(zhuǎn)角無(wú)憂

［6］《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》

［7］Ficoll密度梯度離心法分離PBMC

［8］『精美動(dòng)畫集錦』流式抗體標(biāo)記、破膜、檢測(cè)、分選-流式中文網(wǎng)

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